基因治疗是借助载体把目的基因高效且安全地输送到特定的病变细胞或组织中，从而进行疾病治疗的一种方法。内耳疾病在耳鼻喉科的发病率较高，严重影响人们的健康和生活质量，且目前尚无确切的治疗方法。随着分子生物学的发展，内耳基因治疗研究为攻克这一顽症带来希望。但目前阻碍内耳基因治疗的一大难题就是缺乏理想的基因载体。
内耳基因治疗中常用的载体分病毒载体、非病毒载体两类。病毒载体如逆转录病毒、腺病毒(Ad)、腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）、慢病毒和单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）等，虽然转染效率高，应用范围广，但它容易引起免疫反应，毒性较大，能装载的基因长度也有限，并且有潜在的病毒复制的可能；而非病毒载体中的阳离子脂质体，虽然转染率也相对较高，携带基因长度较病毒增加，但其分子量较大，在体内易被清除，且阳离子脂质体达到一定浓度也会产生严重的细胞毒性，在体内使用具有局限性。
近年来，以非病毒材料为基因载体的基因治疗研究引起了广泛的重视，其中用阳离子聚合物和基因复合形成纳米粒来模拟类似病毒的结构作为基因载体就是一个重要方面。纳米载体作为一种新兴的载体系统，逐渐显示其优势并在内耳基因治疗中拥有广阔前景。
纳米载体作为一种特殊的非病毒基因载体与病毒和阳离子脂质体相比，具有较多优点：免疫原性低；细胞毒性小；可通过对纳米粒表面的修饰，增加其对特殊细胞受体的靶向性，减少副反应；可保护转导基因不受机体血浆或组织细胞中各种补体和酶的破坏，使外源基因在宿主细胞染色体DNA中整合，从而获得长期稳定的表达；能使靶基因缓慢释放，有效延长作用时间。因此，纳米载体成为目前非病毒载体的研究热点，也引起耳科领域的关注。本文就纳米基因载体及其在内耳基因治疗中的研究进展作一综述。
1 纳米基因载体的概念
纳米基因载体粒 (nanoparticle gene vector)是由高分子材料合成的一种固态胶体纳米级颗粒载体，能将DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(双链RNA)等基因治疗分子包裹在纳米粒之中或吸附在表面，通过细胞胞吞将其载入细胞内，通过高分子材料的降解逐渐释放出基因治疗分子，从而发挥其基因治疗效能。由于纳米基因载体为纳米量级的超细微粒，一般在1～100 nm之间，而一般细胞均较之大，这就使其进入细胞成为可能。另外，纳米级大小的微粒具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应等，导致其具有特有的热、磁、光敏感特性和表面稳定性，更容易通过外场（电、磁、光）实现对其性能的控制，有利于实现靶向输送、控制释放、保护和稳定基因治疗分子。同时还具有不易被机体网状内皮细胞清除、有效避免脾滤过效应、通过增加渗透和滞留效应(enhanced penetration and retention，EPR)增强靶组织累积等优势。所以纳米载体具有结合、浓缩基因治疗分子并将其高效导入各种活细胞的能力，而且体外显示无明显细胞毒性。此外，纳米微粒的表面结构和状态可以进行表面修饰，提高微粒表面活性，改善纳米基因载体与其它物质之间的相容性，使微粒表面产生新的理化、机械性能和新功能。目前用于研制基因载体的材料主要有两大类：可生物降解高分子材料和非生物降解高分子材料。前者包括聚α氨基酸，如聚谷氨酸酯、聚赖氨酸（poly-L-lysine,PLL）等及由它们组成的共聚物；聚α羟基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基丁酸及聚ε-己内酯等及它们之间的共聚物；聚原酸酯；聚酐；聚丙烯酰淀粉等。非生物降解高分子材料主要有聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚酰胺等。可生物降解高分子材料较为多用，因为它们在体内生物酶的作用下，可降解为小分子物质，最后分解为水和二氧化碳，避免了载体材料的体内蓄积，具有进一步临床应用的潜力。
2 纳米基因载体在内耳基因治疗中应用的可行性
由于耳蜗结构的特殊性、精细性和一直缺乏有效的靶基因用于内耳疾病的治疗，基因治疗在耳科起步较晚。直到1996年Lalwani等进行了遗传物质直接进入外周听系的可行性研究，才真正开始了对内耳疾病基因治疗的探索。在内耳基因治疗研究中，发现许多生长因子在毛细胞再生中起重要作用，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)等等，研究最多的是碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。许多研究均证实，bFGF可以促进细胞的有丝分裂，对毛细胞损伤后的再生有促进作用。近年来有研究发现一些碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix,bHLH)在毛细胞再生过程中有重要作用，其中Math1基因是毛细胞分化成熟的必需基因。Zheng等发现Math1基因过表达后可以使大上皮嵴区的细胞转化为具有毛细胞表型的细胞，这些细胞表达肌球蛋白Ⅶa（毛细胞的标记抗体）。最新的研究证明过表达该基因可使庆大霉素致聋的成年豚鼠毛细胞再生并伴有听功能的部分恢复。
综观内耳的解剖特点，耳蜗拥有其它器官所没有的特性，为内耳基因治疗提供了理想的环境。从解剖上,它处于骨性被囊内，与周围组织处于相对隔离状态；流动的外淋巴有利于载体在整个蜗管内的扩散，可对毛细胞、螺旋神经节细胞的数量和功能进行精确的分析；最为重要的是有大量的临床病人可能从基因治疗中受益。与病毒载体和阳离子脂质体相比，由于具有适宜特性的纳米微粒可以进入细胞，所以用纳米基因载体进行基因转染具有一些显著的优点：纳米基因载体尺寸小、无毒、无抗原性、有生物相容性、控释作用（可延长基因的表达时间）、表面能极高；具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；能包裹、浓缩、保护基因治疗分子，使其免遭机体血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏；使基因治疗分子缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的分子浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；代谢产物少、副作用少、无免疫排斥反应等；对特殊细胞受体的靶向性、副反应少；使外源基因在宿主细胞染色体DNA中整合，从而获得长期稳定的表达等。可见，纳米基因载体是一种比较理想的用于基因治疗的载体。大量研究表明，在一定条件下，聚阳离子可与基因在水溶液中复合形成纳米微粒。同时，可以在聚阳离子链上引入具有特殊功能的基团（如半乳糖、转铁蛋白）从而使聚阳离子/基因纳米微粒具有类似病毒的功能，如受体调节内化，进入细胞核等。聚阳离子作为基因载体在血浆的电解质环境中仍是稳定的纳米微粒，且在冷冻干燥储存过程中并不失活。
3 纳米基因载体在内耳基因治疗中的应用进展
目前，内耳基因治疗方面的研究主要应用病毒载体在动物体内进行尝试，虽然经病毒介导的转基因方法可使目的基因在内耳组织中得以表达，并可能在内耳组织的发育、存活、对耳毒性药物的拮抗、修复及再生等方面起重要作用，但因病毒载体的局限性，使内耳基因治疗无法应用于临床。而纳米载体作为一种新型基因载体，以其无免疫原性、低毒、装载容量大、制备容易且结构稳定、利于改造和修饰等优势，更有利于内耳基因治疗的进一步研究及临床应用。在基因导入途径上，目前耳科主要是运用鼓阶打孔和圆窗膜注射，通过直接注射和微渗透泵将病毒载体携带目的基因导入外淋巴液。美国密西根州Raphael课题组曾把该病毒携带的Math1基因注入豚鼠内耳中阶中，发现有新生毛细胞产生。但这两种方式都是侵袭性操作，破坏耳蜗鼓阶，存在诱发炎症、外淋巴漏、损坏听力的危险，因此临床上是不可取的。由于圆窗膜具有半透膜的特性——分泌和吸收功能，而纳米基因载体又具有靶向性和通透性，作为一种新技术，有望实现圆窗膜的跨膜导入。因此，作为一种新型基因载体，纳米基因载体在内耳基因治疗的进一步临床研究中是不可替代的。
目前，纳米基因载体主要应用于临床常规治疗无明显效果的疾病及晚期绝症，和其它研究相比，应用纳米基因载体进行内耳基因治疗的研究更少，尚未见临床应用报道。由于纳米基因载体用于内耳的基因治疗拥有其独一无二的特点，使耳科工作者为之振奋，国内外大量研究表明纳米基因载体已经成功携带内耳基因治疗目的基因渗透入圆窗膜从而实现动物耳蜗的基因转染。
Tamura等发现罗丹明包裹的聚乳糖胺（polylactosamine PLGA）纳米粒能渗透豚鼠圆窗膜，并分布于耳蜗鼓阶底回和中回。Ge等发现三氧化二铁包裹的聚乳糖胺纳米粒在磁场的作用下能加快穿透灰鼠的耳蜗圆窗膜，并分布于鼓阶、前庭阶、血管纹的外侧壁和耳蜗螺旋器的内外毛细胞和支持细胞，而磁场对耳蜗底回和顶回无明显影响。Praetorius等的研究表明蓝环素3标记的二氧化硅纳米粒能够穿透大鼠的圆窗膜，分布于螺旋神经节细胞和耳蜗底回、中回和顶回的内毛细胞以及前庭毛细胞和螺旋神经节细胞。并且，在大鼠的对侧对照耳中也发现了相同的纳米分布，表明纳米粒已经通过实验耳的蜗水管进入脑脊液中并最终扩散到对侧耳蜗中。Jiang等在豚鼠耳蜗灌注海人酸造成耳蜗兴奋性损伤后，经耳蜗鼓阶转染羟基磷灰石纳米粒介导的NT-3基因仍可减轻海人酸对耳蜗螺旋神经节细胞的兴奋性毒性损伤。Zou等已经成功在圆窗龛放置含有脂质核纳米粒的明胶海绵实现纳米粒的跨圆窗膜导入，同时脂质核纳米粒能够转染耳蜗螺旋神经节细胞、神经纤维、螺旋韧带和内外毛细胞，证实纳米粒基因载体是一种具有潜能的基因载体。
以上实验表明，无需对耳蜗进行物理损伤，纳米载体能够成功穿透耳蜗圆窗膜，并分布于耳蜗螺旋器的各种膜性结构和细胞上。尽管目前仍未阐明纳米载体的转染机制，但认为纳米载体的粒径是影响其内耳圆窗膜渗透和分布的关键因素。实验将会进一步证实影响纳米基因载体内耳分布的特性及其对内耳特殊组织和细胞的靶向性。
4 展望
近年来，应用纳米基因载体进行内耳基因治疗的实验虽取得了一些成果，但仍然处于体外试验及动物试验阶段，而制备安全、高效、表达稳定、易于生产的新型纳米基因载体是内耳基因治疗的关键。尽管纳米基因载体在其他疾病的研究中已经取得了可喜的进展，如聚乙二醇（poly ethylene glycol，PEG）由于免疫原性和抗原性极低，已经通过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）认证，可作为人体内使用的聚合物。然而，如何成功构建内耳组织特异性载体、提高基因转染效率从而保障内耳基因治疗的高效性和安全性等问题尚需进一步研究。不过可以肯定，作为纳米技术和基因治疗相结合的产物，纳米基因载体在内耳基因治疗这一特殊领域是极具发展潜力的。随着纳米材料的不断更新，纳米技术的不断发展，纳米基因载体将会以其优越的性能在内耳基因治疗中发挥更重要的作用并最终应用于临床。
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